De film speelt zich een jaar na de gebeurtenissen in Captain America: The First Avenger en draait om agent Carter die op zoek gaat naar de mysterieuze Zodiac. Tot ongenoegen van haar baas (agent Flynn) rond ze een missie succesvol af zonder de benodigde permissie van hem te hebben verkregen. Aanvankelijk weigert hij dan ook om haar nog op andere missie te laten gaan. Flynn krijgt echter een telefoontje van Howard Stark die hem vertelt dat Carter bij S.H.I.E.L.D. kan komen werken.